新型單堿基編輯工具可顯著降低基因編輯脫靶效應(yīng)
北京時(shí)間5月18日晚間，學(xué)術(shù)期刊《自然-方法學(xué)》（Nature Methods）在線發(fā)表了來(lái)自中國(guó)農(nóng)科院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所、中科院上海生命科學(xué)研究院神經(jīng)科學(xué)研究所、中科院計(jì)算生物學(xué)研究所、上海交通大學(xué)、上?？萍即髮W(xué)、復(fù)旦大學(xué)等團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究，題為“A rationally engineered cytosine base editor retains high on-target activity while reducing both DNA and RNA off-target effects”。
研究團(tuán)隊(duì)根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)了基因編輯過(guò)程中決定脫靶的重要氨基酸，并在不影響催化活性的情況下突變相應(yīng)的氨基酸，得到了顯著減低基因編輯脫靶效應(yīng)的單堿基編輯工具。
這篇論文的通訊作者為中國(guó)農(nóng)科院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所研究員、研究組長(zhǎng)左二偉，中科院神經(jīng)科學(xué)研究所研究員、靈長(zhǎng)類(lèi)疾病模型研究組組長(zhǎng)楊輝，中科院計(jì)算生物學(xué)研究所（中國(guó)科學(xué)院-馬普學(xué)會(huì)計(jì)算生物學(xué)研究所）研究員李亦學(xué)。左二偉同時(shí)為一作者。
CRISPR/Cas9是廣泛關(guān)注的新一代基因編輯工具，自從2012年被發(fā)明以來(lái)備受外界期待。而單堿基編輯技術(shù)是CRISPR/Cas9的衍生工具，該技術(shù)可以在不切斷DNA雙鏈的情況下實(shí)現(xiàn)單核苷酸的定向突變，為治療單堿基突變引起的遺傳性疾病帶來(lái)了希望。
目前已知的人類(lèi)致病遺傳變異中，約58%都屬于點(diǎn)突變，而約15%的致病點(diǎn)突變都屬于T·A--C·G變異。2016年，美國(guó)博德研究所、哈佛大學(xué)的David Liu的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)出新型單堿基編輯器CEB（Cytosine Base Editor）。
但從2019年開(kāi)始，單堿基編輯工具的安全性受到了質(zhì)疑。楊輝、美國(guó)麻省總醫(yī)院J. Keith Joung等國(guó)內(nèi)外多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)此前發(fā)文報(bào)道了單堿基編輯器存在嚴(yán)重的DNA和RNA脫靶效應(yīng)，該效應(yīng)可能會(huì)引起包括癌癥在內(nèi)的多種非預(yù)期的副作用。與此同時(shí)，國(guó)內(nèi)外多位科學(xué)家通過(guò)多種方式研究降低基因編輯DNA和RNA脫靶的方法，取得了一定進(jìn)展，但也存在一定局限。
目前廣泛使用的堿基編輯用的是大鼠APOBEC1（rAPOBEC1）酶，該酶誘導(dǎo)DNA胞嘧啶（C）脫氨，該系統(tǒng)由連接的Cas蛋白、指導(dǎo)RNA（gRNA）、rAPOBEC1組成。在此次研究中，左二偉、楊輝等人使用研究團(tuán)隊(duì)此前開(kāi)發(fā)的新型脫靶檢測(cè)技術(shù)GOTI（Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection）和RNA-Seq同時(shí)檢測(cè)了CEB突變體的DNA脫靶和RNA脫靶。他們同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，DNA和RNA的脫靶是互相獨(dú)立的，需要同時(shí)檢測(cè)。
研究團(tuán)隊(duì)描述了23個(gè)合理設(shè)計(jì)的CBE突變體的篩選，揭示了在預(yù)測(cè)DNA結(jié)合位點(diǎn)上的突變氨基酸可以顯著降低Cas-9脫靶效應(yīng)。
此外，他們還獲得了一個(gè)CBE突變體YE1-BE3-FNLS。研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，他們獲得的 YE1-BE3-FNLS是高精度、高活性單堿基編輯工具，顯著降低了脫靶效應(yīng)并提高了編輯效率，有望應(yīng)用于遺傳疾病基因治療，推動(dòng)基因編輯臨床化應(yīng)用。
據(jù)介紹，GOTI是左二偉、楊輝等團(tuán)隊(duì)合作建立的全新一代基因編輯脫靶檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)在靈敏性、準(zhǔn)確性和適用范圍上遠(yuǎn)超之前的脫靶檢測(cè)技術(shù)，該研究成果于2019年3月發(fā)表于《科學(xué)》（Science）。研究團(tuán)隊(duì)隨后基于GOTI深入探索解決單堿基編輯器脫靶效應(yīng)的方法，此次研究成果是這一系列研究中取得的研究進(jìn)展之一。
值得一提的是，此前的2月10日，David Liu也在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊《自然-生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）提出了一種方案。他們篩選不同CBE在大腸桿菌和人細(xì)胞中誘導(dǎo)Cas9非依賴(lài)的脫氨傾向，找到了降低Cas9非依賴(lài)型DNA脫靶風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵，并通過(guò)蛋白質(zhì)工程等策略構(gòu)建出一系列低脫靶風(fēng)險(xiǎn)的高活性CBE系統(tǒng)，其中YE1-BE4在保持較高的編輯效率的同時(shí)降低了DNA和RNA上的脫靶，并且同時(shí)縮小了編輯窗口。
論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-020-0832-x
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